Reference genes for studies in infectious parasitic diseases in five types of human tissues

Gene expression analyses based on messenger RNA (mRNA) expression require accurate data normalization. When using endogenous reference genes, these should be carefully validated. Validated reference genes vary greatly depending on tissue, cell subsets and experimental context. This study was aimed to identify reference genes that have more stable mRNA levels among individuals in peripheral blood mononuclear cells (PBMC); fresh skin biopsies; lung and brain autopsies as well as, skin biopsies formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE). Therefore, 6 endogenous reference genes were evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction: 18S rRNA, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), TATA box-binding protein (TBP), beta-2-microbolin (B2M), ubiquitin C (UBC) and mitochondrially encoded ATP synthase 6 (MT-ATP6). Furthermore, validation of their stabilities and performance as reference genes was determined by geNorm and NormFinder programs. The results show that the most stable genes for PBMC and fresh skin biopsies were TBP and UBC; in FFPE lung autopsies and skin biopsies were GAPDH and B2M; and in FFPE brain autopsies were GAPDH and UBC. In addition, 18S rRNA was the least stable of all genes analyzed. These data concluded that even genes constitutively expressed have transcript level variations in different tissues as well as storage and experimental conditions. These observations suggest that suitable reference genes should be selected for normalization of gene expression data analysis.

As análises de expressão gênica baseadas na expressão do RNA mensageiro (mRNA) requerem normalização precisa dos dados. Ao usar genes de referência endógenos, estes devem ser cuidadosamente validados. Os genes de referência validados variam muito, dependendo do tecido, subconjuntos de células e contexto experimental. Este estudo teve como objetivo identificar genes de referência que apresentam níveis de mRNA mais estáveis ​​entre indivíduos em células mononucleares do sangue periférico (PBMC); biópsias de pele fresca; autópsias pulmonares e cerebrais, bem como biópsias de pele fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE). Portanto, 6 genes de referência endógenos foram avaliados por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real: rRNA 18S, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteína de ligação à caixa TATA (TBP), beta-2-microbolina (B2M), ubiquitina C (UBC) e ATP sintase 6 mitocondrialmente codificada (MT-ATP6). Além disso, a validação de suas estabilidades e desempenho como genes de referência foi determinada pelos programas geNorm e NormFinder. Os resultados mostram que os genes mais estáveis ​​para PBMC e biópsias de pele fresca foram TBP e UBC; nas autópsias pulmonares de FFPE e biópsias de pele foram GAPDH e B2M; e nas autópsias cerebrais de FFPE foram GAPDH e UBC. Além disso, o 18S rRNA foi o menos estável de todos os genes analisados. Esses dados concluíram que mesmo os genes expressos constitutivamente apresentam variações no nível de transcrição em diferentes tecidos, bem como condições experimentais e de armazenamento. Essas observações sugerem que genes de referência adequados devem ser selecionados para normalização da análise dos dados de expressão gênica.

Identification of Leishmania spp. promastigotes in the intestines, ovaries, and salivary glands of Rhipicephalus sanguineus actively infesting dogs

Sand flies are recognized as the major vector of canine visceral leishmaniasis. However, in some areas of Brazil where sand flies do not occur, this disease is found in humans and dogs. There has been speculation that ticks might play a role in transmission of canine visceral leishmaniasis and the DNA of Leishmania spp. has been reported in whole ticks. We investigated the presence of Leishmania spp. promastigotes in the intestines, ovaries, and salivary glands of Rhipicephalus sanguineus ticks collected from tick-infested dogs in two cities of Brazil. We used 66 dogs that tested positive and 33 that tested negative for Leishmania spp. according to direct cytological examination assays. Ten ticks were collected from each dog and dissected to collect the intestines, ovaries, and salivary glands for immunohistochemistry (IHC) and diagnostic real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). IHC results showed Leishmania spp. in 98, 14, and 8 % of the intestines, ovaries, and salivary glands, respectively. Real-time PCR showed that 89, 41, and 33 % of the tick intestine, ovary, and salivary glands, respectively, were positive for Leishmania spp. The verification of promastigotes of Leishmania spp. by two independent techniques in ticks collected from these urban region dogs showed that there is need for clarification of the role of ticks in the transmission of canine visceral leishmaniasis in Brazil.

Detection of Leishmania (Viannia) braziliensis by PCR in samples collected by scraping the lesion edges from patients of an endemic area

American cutaneous leishmaniasis (ACL) is an infectious disease caused by Leishmania. Their diagnosis is performed in samples collected from the lesion biopsies, which has to be performedby physicians. For simplifying the sample collection, this study proposes a minimally invasive procedure, by scraping the lesion edges. Laboratory diagnosis by PCR was performed and compared with the microscopic examination, by analyzing 28 samples collected from patients with suspicion of ACL. Sample collected from the lesion edge with a sterile toothpick was divided into two aliquots. One aliquot was analyzed under direct microscopy, and the second by PCR, by using two primer pairs (one for Leishmania genus and other for L. (V.) braziliensis). Of 28 samples, 27 (96.43 %) showed concordant results in both methodologies (eight positive and 20 negative). The PCR methodologyis an invaluable tool: (i) to determine the Leishmania species; (ii) to provide an alternative procedure of sample collection, when an authorized professional is not available in the respective health service;and (iii) to propose a minimally invasive procedure for collecting biological material...

GENOTYPE CHARACTERIZATION OF Leishmania (Viannia) braziliensis ISOLATED FROM HUMAN AND CANINE BIOPSIES WITH AMERICAN CUTANEOUS LEISHMANIASIS / Caracterização genotípica de isolados de Leishmania (Viannia) braziliensis provenientes de biopsias de humanos e cães com leishmaniose tegumentar americana

Introduction: American tegumentary leishmaniasis (ATL) can be caused by Leishmania (Viannia) braziliensis complex. The evolution of ATL initially results in lesions and can develop into disseminated or diffuse forms. The genetic diversity of L. (V.) braziliensis in some endemic areas of Brazil has been poorly studied, such as in the state of São Paulo. This study analyzed the genetic diversity of L. (V.) braziliensis isolates collected from patients and dogs with LTA from the state of São Paulo. Methods: Leishmaniasis diagnosis was determined by PCR. The 132 biopsies were collected in different regions of Sao Paulo State, Brazil (36 municipalities). The genetic characterization of L. (V.) braziliensis isolates was tested by RFLP-PCR using DNA extracted from biopsies. The primer set amplified a specific region of Leishmania internal transcribed spacers of the ribosomal DNA locus. Results: Of the 132 samples, 52 (40%) were completely genotyped by RFLP-PCR (44 from human patients and eight from dogs). The results showed nine distinct patterns. The majority of the genotyped samples were from Sorocaba (30), and the others were distributed among 14 other municipalities. The first pattern was more frequent (29 samples), followed by pattern 2 (nine samples) and pattern 3 (three samples). Patterns 4, 6, 7, 8 and 9 were composed of two samples each and pattern 5 of one sample. Conclusion: These results suggest that polymorphic strains of L. (V.) braziliensis circulate in the state of São Paulo. These data agree with studies from other regions of Brazil, showing great variability among the natural populations of endemic foci. .

Introdução: A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada pelo sub-gênero Leishmania (Viannia) braziliensis. A evolução da LTA resulta com a evolução das lesões iniciais. A diversidade genética de L. (V.) braziliensis em algumas áreas endêmicas brasileiras, como no estado de São Paulo, é pouco conhecida. Assim, este estudo teve como objetivo analisar a variabilidade genética de isolados de L. (V.) braziliensis coletados de biopsias de pacientes e cães com LTA no estado de São Paulo. Métodos: O diagnóstico da leishmaniose foi realizado por PCR. As 132 biópsias analisadas foram coletadas em diferentes regiões do Estado de São Paulo, Brasil (36 municípios). A caracterização genética de L. (V.) braziliensis foi realizada por RFLP-PCR utilizando DNA extraído das biopsias. O conjunto de iniciadores utilizado amplificou a região ITS de Leishmania. Resultados: Das 132 amostras analisadas, 52 (40%) foram completamente genotipadas por RFLP-PCR (44 de pacientes e oito de cães). Os resultados mostraram nove padrões distintos. A maioria das amostras genotipadas foi de Sorocaba (30), e as demais foram distribuídas entre 14 outros municípios. O primeiro padrão foi mais frequente (29 amostras), seguido pelo padrão 2 (nove amostras), padrão 3 (três amostras). Padrões 4, 6, 7, 8 e 9 foram compostos de duas amostras de cada um e o padrão 5, com uma amostra. Conclusão: Estes resultados sugerem que cepas polimórficas de L. (V.) braziliensis circulam no estado de São Paulo. Estes dados são concordantes com estudos em outras regiões do Brasil, mostrando grande variabilidade destas populações naturais de focos endêmicos. .

Genotypic identification of Cryptosporidium spp. isolated from hiv-infected patients and immunocompetent children of São Paulo, Brazil / Identificação genotípica de Cryptosporidium spp. isolados a partir de pacientes com HIV e crianças imunocompetentes de São Paulo, Brasil

Cryptosporidium isolates identified in fourteen stool samples, collected from five HIV-infected patients and nine immunocompetent children, living in the Sate of São Paulo, Brazil, were submitted to a molecular analysis using a nested PCR followed of restriction fragment length polymorphism (RFLP), for genetic characterization. The analysis was based on digestion with RsaI restriction enzyme of a DNA fragment amplified from the Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP) gene. Based on this analysis, four samples were identified as Cryptosporidium parvum, eight as Cryptosporidium hominis and two presented a profile that correspondedto Cryptosporidium meleagridis when compared to the standards used in the analysis. The use of molecular methods can be helpful to identify source of infections and risk factors related to Cryptosporidium infection in our communities.

Isolados de Cryptosporidium identificados em quatorze amostras de fezes, coletadas de cinco pacientes com infecção por HIV e de nove crianças imunocompetentes, residentes no estado de São Paulo, Brasil, foram submetidos a análise molecular por Nested-PCR, seguido da caracterização genética por polimorfismo do tamanho do fragmento de restrição (RFLP). A análise foi baseada na digestão, com a enzima de restrição RsaI, de um fragmento de DNA amplificado do gene que codifica a proteína de parede do oocisto de Cryptosporidium (COWP). Baseado nesta análise, quando comparadas aos padrões utilizados, quatro amostras foram identificadas como Cryptosporidium parvum, oito como Cryptosporidium hominis e duas apresentaram um perfil correspondente ao de Cryptosporidium meleagridis. O uso de métodos moleculares pode ser útil para identificar a fonte das infecções e os fatores de risco relacionados à infecção por Cryptosporidium em nossas comunidades.

Contribuição da reação da polimerase em cadeia no diagnóstico e às ações de vigilância epidemiológica das leishmanioses tegumentar e visceral no Estado de São Paulo

As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias que apresentam diferentes manifestações clínicas e grande diversidade epidemiológica. O objetivo deste estudo foi o de padronizar a PCR, para diferenciar L. (L.)chagasi de L. (V.) braziliensis em amostras biológicas, visto que ambas as espécies são prevalentes no Estado de São Paulo. Este trabalho foi dividido em três partes. A primeira restringiu-se à escolha e avaliação dos marcadores específicos e à padronização da reação. Na segunda, avaliou-se a PCR (PCR-L. (L.) chagasi) utilizando um marcador específico para o diagnóstico da leishmaniose visceral americana (LVA) em 114 amostras caninas (44 cães sintomáticos e 70 assintomáticos) em um estudo prospectivo. A sensibilidade e especificidade da reação foram avaliadas a partir dos métodos parasitológicos (microscopia direta e cultura in vitro). Houve 92% de concordância entre os métodos parasitológicos e a PCR-L. (L.) chagasi. Das 61 amostras positivas na PCR-L. (L.) chagasi, 49 foram positivas pelos métodos parasitológicos. A especificidade também foi alta, pois não foram observadas reações positivas com outras espécies utilizadas no controle. Nas amostras negativas de 61 cães os métodos parasitológicos foram positivos em 5 dessas amostras. Esses resultados discordantes revelaram que estes animais poderiam estar com leishmaniose tegumentar americana (LTA), o que foi confirmado pela PCRL. (V.) braziliensis positiva. Na terceira parte avaliou-se a PCR-L. (V.) braziliensis em lesões humanas. As amostras analisadas foram coletadas de pacientes atendidos em ambulatórios da região de Sorocaba, que é a segunda região de maior endemicidade para LTA no Estado de São Paulo. Biópsias de lesões de 109 pacientes foram analisadas por PCR-L. (V.)braziliensis, métodos parasitológicos, reação intradérmica de Montenegro e análise histopatológica. O diagnóstico definitivo da LTA, baseado na análise clínica e na visualização do parasito, evidenciou 52 pacientes positivos...

Contribuição da reação da polimerase em cadeia no diagnóstico e às ações de vigilância epidemiológica das leishmanioses tegumentar e visceral no Estado de São Paulo / Contribuition of polymerase chain reaction in the diagnosis and control action and epidemiological surveillance of cutaneous and visceral leismaniasis in the São Paulo State

As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias que apresentam diferentes manifestações clínicas e grande diversidade epidemiológica. O objetivo deste estudo foi o de padronizar a PCR, para diferenciar L. (L.)chagasi de L. (V.) braziliensis em amostras biológicas, visto que ambas as espécies são prevalentes no Estado de São Paulo. Este trabalho foi dividido em três partes. A primeira restringiu-se à escolha e avaliação dos marcadores específicos e à padronização da reação. Na segunda, avaliou-se a PCR (PCR-L. (L.) chagasi) utilizando um marcador específico para o diagnóstico da leishmaniose visceral americana (LVA) em 114 amostras caninas (44 cães sintomáticos e 70 assintomáticos) em um estudo prospectivo. A sensibilidade e especificidade da reação foram avaliadas a partir dos métodos parasitológicos (microscopia direta e cultura in vitro). Houve 92% de concordância entre os métodos parasitológicos e a PCR-L. (L.) chagasi. Das 61 amostras positivas na PCR-L. (L.) chagasi, 49 foram positivas pelos métodos parasitológicos. A especificidade também foi alta, pois não foram observadas reações positivas com outras espécies utilizadas no controle. Nas amostras negativas de 61 cães os métodos parasitológicos foram positivos em 5 dessas amostras. Esses resultados discordantes revelaram que estes animais poderiam estar com leishmaniose tegumentar americana (LTA), o que foi confirmado pela PCRL. (V.) braziliensis positiva. Na terceira parte avaliou-se a PCR-L. (V.) braziliensis em lesões humanas. As amostras analisadas foram coletadas de pacientes atendidos em ambulatórios da região de Sorocaba, que é a segunda região de maior endemicidade para LTA no Estado de São Paulo. Biópsias de lesões de 109 pacientes foram analisadas por PCR-L. (V.)braziliensis, métodos parasitológicos, reação intradérmica de Montenegro e análise histopatológica. O diagnóstico definitivo da LTA, baseado na análise clínica e na visualização do parasito, evidenciou 52 pacientes positivos e 57 negativos.

Detecção de Cryptosporidium meleagridis em amostras fecais de pacientes HIV positivos no Brasil / Detection of Cryptosporidium meleagridis in fecal samples of HIV-infected patients from Brazil

Amostras fecais de indivíduos portadores de HIV, e com Aids, foram submetidas ao diagnóstico laboratorial de criptosporidiose. Do total de 29 amostras, 15 apresentaram oocistos de Cryptosporidium sp no exame parasitológico, 13 foram reativas em ELISA para detecção de coproantígenos e em 16 foram obtidos produtos de amplificação por Nested-PCR. Foi realizada caracterização genotípica em cinco destes produtos amplificados, por meio de PCR-RFLP com a enzima de restrição AfaI (RsaI). Dois isolados foram identificados como Cryptosporidium hominis, um como Cryptosporidium parvum e dois apresentaram perfil eletroforético correspondente a Cryptosporidium meleagridis. Esses achados trazem evidências de que diferentes espécies de Cryptosporidium circulam no ambiente, traduzindo-se em risco tanto para humanos quanto para outros animais.

Detecção de Cryptosporidium em amostras fecais por técnica de Nested-PCR e comparação com métodos imunológico e parasitológico / Detection of Cryptosporidium in fecal samples tested by Nested-PCR and comparison between immunologic and parasitologic methos

A criptosporidiose é causada por protozoários do gênero Cryptosporidium. A doença se caracteriza por diarréia aguda no homem e em outros animais. O diagnóstico laboratorial é feito pela detecção do parasito por métodos parasitológicos, imunológicos ou moleculares. Amostras fecais de 29 pacientes portadores de HIV e com AIDS analisadas pelos métodos parasitológico (Kinyoun) e imunológico (ELISA) foram submetidas ao método molecular (Nested-PCR). Destas, 15 amostras foram positivas para Cryptosporidium sp no exame parasitológico e 14 negativos para Cryptosporidium, mas positivos para outras espécies parasitárias ou bacilos álcool-acido-resistentes. Pela Nested-PCR foram encontradas 16 amostras positivas, e destas, 11 apresentaram resultados concordantes com o exame parasitológico e cinco não. Essas cinco amostras discordantes foram também negativas pelo ELISA. Das 15 amostras positivas pelo exame parasitológico, duas foram negativas pelo Nested-PCR e por ELISA. Os métodos moleculares podem-se constituir em importante ferramenta diagnóstica nos casos com suspeita clínica de criptosporidiose nos estudos epidemiológicos, permitindo a caracterização genotípica do parasito e auxiliando na investigação das rotas de transmissão. As discordâncias observadas entre os diferentes métodos precisam ser mais bem investigadas

Estudo comparativo entre métodos morfológico, imunológico e molecular aplicados ao diagnóstico da criptosporidiose em amostras fecais de pacientes portadores do vírus hiv e com aids / Cryptosporidiosis: comparative study of morfological, immunological and molecular diagnosis methods in fecal samples from patients with hiv and aids

Cryptosporidium parvum, protozoário da sub classe Coccidia, é um agente causador de diarréia aguda no homem e outros animais. A criptosporidiose é auto-limitada em indíviduos sadios, mas se apresenta como uma doença grave e crônica nos pacientes imuno-comprometidos, principalmente com AIDS. O diagnóstico laboratorial é feito geralmente pela detecção do parasita por métodos morfológicos, mas técnicas imunológicas ou moleculares podem também ser usadas. Neste estudo, utilizaram-se 100 amostras fecais, provenientes de pacientes portadores de HIV e com AIDS, que já haviam sido analisadas previamente por métodos parasitológicos. Estas amostras foram submetidas a diferentes métodos de detecção para Cryptosporidium sp, o método morfológico (visualização através de coloração por Kinyoun) e o teste imunoenzimático (ELISA) para pesquisa de coproantígenos. Destas, foram selecionadas 29 amostras, sendo 15 positivas e 14 negativas para Cryptosporidium pela coloração de Kinyoun, as quais foram submetidas à metodologia molecular de “Nested” PCR (N-PCR). Entre as 15 amostras positivas para Cryptosporidium por método morfológico, 13 foram positivas por ELISA e apenas 11 por N-PCR. Duas amostras positivas por método morfológico e negativas por ELISA, apresentaram-se negativas por N-PCR. Das 16 amostras positivas por N-PCR, 11 foram positivas e cinco negativas por métodos morfológico e ELISA. O método de coloração pelo Kinyoun demonstrou ser ainda um bom método para ser utilizado na rotina diagnóstica da criptosporidiose. O teste de ELISA apresentou resultados compatíveis com os resultados obtidos na coloração de Kinyoun e, devido à capacidade de automação, pode ser empregado em estudos epidemiológicos, otimizando exames em grande demanda. O método molecular (PCR e N-PCR), para ser introduzido em nosso meio como método de rotina diagnóstica da criptosporidiose, necessita de aprimoramentos nas técnicas de extração de DNA, entretanto já é conhecida sua sensibilidade e especificidade, constituindo-se em importante ferramenta para estudos epidemiológicos com a possibilidade de caracterizar diferentes espécies e genótipos de Cryptosporidium

Condições higiênico-sanitárias de verduras e legumes comercializados no CEAGESP de Sorocaba - SP / Higienic and sanitary conditions of vegetables and greens sold in CEAGESP, Sorocaba -SP

Os vegetais, legumes e frutas apresentam grande potencial de risco na transmissão de agentes patogênicos. As condições técnicas de cultivo, armazenamento, transporte e distribuição para o consumidor, a prática do uso de adubo orgânico (esterco animal e vegetal), a utilização de águas contaminadas para irrigação, o transporte feito em engradados abertos e as condições de higiene no manuseio e preparo das refeições, são condições que favorecem a transmissão, principalmente quando o produto é consumido cru. A capacidade destes microrganismos causar infecções está diretamente relacionada à virulência, carga parasitária ingerida, inalada ou absorvida, e fatores como idade, estado nutricional, condições imunológicas e outras patologias associadas podem favorecer quadros patogênicos e agravos. Analisaram-se 105 amostras, sendo 72 de verduras e 33 de legumes. Utilizaram-se os métodos bacteriológicos recomendados no "Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods". O método para análise parasitológica foi sedimentação espontânea das águas de enxágue, e lavagem individual das folhas, em solução Tween 80, diluído 1:1000; o sedimento foi observado em microscopia ótica, utilizando lugol como corante. Os resultados demonstraram 45 amostras positivas para a presença de coliformes fecais e 32 para um ou mais parasitos: ovos de Ascaris lumbricoides, larvas de Ancilostomídeos e de Strongyloides. Não houve isolamento de Salmonella sp. O trabalho veio contribuir para as ações da Vigilância Epidemiológica e Sanitária, na orientação aos produtores, com o objetivo de reduzir contaminantes e assim promover a saúde dos consumidores.